亚洲v欧美v国产v在线成_制服丝袜中文字幕丝袜专区_一区二区三区韩国电影_激情欧美一区二区中文字幕

我要投稿 投訴建議

觀(guān)察異補(bǔ)骨脂素體外對(duì)HepG2細(xì)胞毒性和細(xì)胞內(nèi)膽汁酸濃度的影響論

時(shí)間:2021-04-03 15:53:20 畢業(yè)論文范文 我要投稿

觀(guān)察異補(bǔ)骨脂素體外對(duì)HepG2細(xì)胞毒性和細(xì)胞內(nèi)膽汁酸濃度的影響論

  異補(bǔ)骨脂素是一種呋喃香豆素類(lèi)成分,存在于補(bǔ)骨脂等多種藥材中,2010藥典中將異補(bǔ)骨脂素及其同分異構(gòu)體補(bǔ)骨脂素作為藥材補(bǔ)骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)的質(zhì)量控制成分。補(bǔ)骨脂可用于治療更年期綜合征、骨質(zhì)疏松等,其中異補(bǔ)骨脂素有雌激素樣作用,可選擇性作用于雌激素受體α,可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟,有利于骨質(zhì)疏松的治療,是補(bǔ)骨脂中一種有效成分。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)臨床中補(bǔ)骨脂及其相關(guān)制劑可能導(dǎo)致肝損害并有膽汁淤積的表現(xiàn),而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂苷為主要成分的補(bǔ)骨脂水提物有明顯肝毒性,更有研究表明異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂素對(duì)小鼠肝功能有一定影響,這提示補(bǔ)骨脂導(dǎo)致的膽汁淤積性肝損害現(xiàn)象可能與異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂素有關(guān)。更進(jìn)一步推測(cè)就是異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂素干擾了膽汁酸的正常合成轉(zhuǎn)運(yùn),從而導(dǎo)致膽汁淤積的發(fā)生。肝細(xì)胞膜上的與膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體,這些酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體在膽汁酸的合成轉(zhuǎn)運(yùn)中起到重要的作用,并且肝細(xì)胞內(nèi)存在FXR(法尼醇X受體,farne瞫oidXreceptor)、PXR(孕烷X受體,pregnaneXre瞔eptor)等受體可以調(diào)節(jié)相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體[9-10]。本研究考察了異補(bǔ)骨脂素作用24h后HepG2細(xì)胞中相關(guān)酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體等mRNA的變化,以了解異補(bǔ)骨脂素對(duì)于膽汁酸合成轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,為解釋異補(bǔ)骨脂素在膽汁酸淤積中的作用機(jī)制、以及更進(jìn)一步也闡明補(bǔ)骨脂毒性提供基礎(chǔ)。

  1 材料

  1.1 受試藥

  異補(bǔ)骨脂素購(gòu)自天津市月牙湖科技有限公司,經(jīng)HPLC檢測(cè)純度大于95%。

  1.2 細(xì)胞

  HepG2細(xì)胞,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

  1.3 試劑與儀器

  DMEM培基和無(wú)血清Opti睲EM培基,胎牛血清(FBS)為Gibco產(chǎn)品;青霉素-鏈霉素雙抗、胰酶、DMSO、DEPC水為北京索萊寶產(chǎn)品;PBS為武漢博士德產(chǎn)品;TRIzol為Invitrogen產(chǎn)品;RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit為Fermen瞭as產(chǎn)品;Hotstartfluo睵CRmixSYBRGreenⅠ(2×)為上海生工產(chǎn)品;BCA蛋白檢測(cè)試劑盒為T(mén)her瞞o產(chǎn)品;總膽汁酸(TBA)試劑盒為中生北控產(chǎn)品;其它化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。Hitachi7020全自動(dòng)生化儀;PerkinElmerEn瞫pire多功能讀板機(jī);ThermoStratos離心機(jī);Bio睷adCFX96型熒光定量PCR儀;OlympusBX51型倒置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng);上海世平SPH103B恒溫振蕩器。

  2 方法

  2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

  HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 的FBS、1%雙抗的DMEM的培基中,置37℃、5% CO2的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁24h,每48h換液1次,先用無(wú)菌PBS洗細(xì)胞3次,再加0.25%的胰酶消化。細(xì)胞懸液離心(1000r·min-1,4℃,10min)后棄上清,加入含10% FBS的完全培養(yǎng)基,反復(fù)吹打細(xì)胞至單細(xì)胞懸液,進(jìn)行傳代和種板。

  2.2 細(xì)胞活力和細(xì)胞中膽汁酸檢測(cè)

  HepG2細(xì)胞按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24h貼壁后,分別給予用Opti睲EM培基稀釋的終濃度為6.25、25、100、400μmol·L-1的異補(bǔ)骨脂素,作用24h后移除培養(yǎng)基,加10μLMTT溶液(5g·L-1)溫箱孵育4h,移除上清每孔加入100μL的DMSO,振蕩10min后在490nm處測(cè)得吸光度值。計(jì)算細(xì)胞存活率(相對(duì)于對(duì)照組)。HepG2細(xì)胞按每孔1×105 個(gè)接種于24孔板中,在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24h貼壁后,分別給予用Opti睲EM培基稀釋的'終濃度為6.25、25、100、400μmol·L-1的異補(bǔ)骨脂素,作用24h后移除培養(yǎng)基,加入PBS緩沖液100μL,用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞,細(xì)胞用超聲破碎細(xì)胞,BCA法檢測(cè)細(xì)胞破碎液的蛋白濃度,并在全自動(dòng)生化儀檢測(cè)TBA。

  2.3 RealtimePCR檢測(cè)

  HepG2細(xì)胞按每孔5×105個(gè)接種于6孔板,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,然后給予異補(bǔ)骨脂素(25、100μmol·L-1,Opti睲EM培基稀釋)處理24h。去除培養(yǎng)液,用PBS洗細(xì)胞3次。用TRIzol常規(guī)提取HepG2細(xì)胞中總RNA,-80℃保存。紫外分光光度法檢測(cè)RNA__樣品的純度與濃度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,realtimePCR反應(yīng)體系20μL,其中cDNA樣本1μL,上、下游引物各0.5μL,HotstartFluo睵CRmix試劑10μL,無(wú)RNA酶水8μL。在94℃預(yù)變性4min,每個(gè)循環(huán)94℃變性30s,57℃退火30s,72℃延伸30s,共40個(gè)循環(huán)。取2-△△CT值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

  2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

  實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以珋x±s表示,組間比較采用單因素方差分析。

  3 結(jié)果

  3.1 對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的影響

  異補(bǔ)骨脂素作用于HepG2細(xì)胞24h,6.25μmol·L-1異補(bǔ)骨脂素即對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有一定抑制作用,細(xì)胞相對(duì)存活率為92.8%。在625~400μmol·L-1范圍內(nèi)隨著異補(bǔ)骨脂素的濃度升高、細(xì)胞存活率也明顯降低,而400μmol·L-1異補(bǔ)骨脂素作用下細(xì)胞相對(duì)存活率僅為27.9%。異補(bǔ)骨脂素作用24h的IC50為118.1μmol·L-1(95%可信限107.1-130.2μmol·L-1)見(jiàn)Fig1A。對(duì)細(xì)胞破碎液的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),異補(bǔ)骨脂素作用24h后,400.0μmol·L-1的異補(bǔ)骨脂素處理組HepG2細(xì)胞內(nèi)膽汁酸濃度升高約5倍,100.0μmol·L-1處理組的細(xì)胞內(nèi)膽汁酸濃度也明顯升高,見(jiàn)Fig1B。

  3.2 對(duì)膽汁酸合成轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

  異補(bǔ)骨脂素處理24h后,HepG2細(xì)胞中BSEP、NTCP的mRNA雖然與空白相比均值有一定變化、但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;25μmol·L-1異補(bǔ)骨脂素組,HepG2細(xì)胞中MRP2、MRP3、CYP7A1的mRNA轉(zhuǎn)錄均明顯降低,而100μmol·L-1異補(bǔ)骨脂素組,除了MRP2、MRP3、CYP7A1的降低外,OATP2、OSTα、CYP27A1、FXR、PXR的mRNA轉(zhuǎn)錄明顯升高。

  4 討論

  異補(bǔ)骨脂素在體外HepG2細(xì)胞中作用24h的IC50為118.1μmol·L-1,但其毒性作用的最小毒性劑量很小,按實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以擬合量效方程并計(jì)算IC5僅為3.8μmol·L-1,提示異補(bǔ)骨脂素的安全劑量較低。

  將細(xì)胞培養(yǎng)基中的藥物濃度近似為血液中的藥物濃度,可以借助于體內(nèi)代謝研究結(jié)果來(lái)先對(duì)體外研究結(jié)果進(jìn)行外推。大鼠代謝研究表明,大鼠口服給予香豆素混合物(相當(dāng)于異補(bǔ)骨脂素4.39mg·kg-1),異補(bǔ)骨脂素在血液中峰濃度高達(dá)37.89mg·L-1,口服的生物利用度高達(dá)70.35%。同時(shí)有研究表明異補(bǔ)骨脂苷在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為異補(bǔ)骨脂素,那么實(shí)際使用補(bǔ)骨脂時(shí)血液中異補(bǔ)骨脂素的來(lái)源除了異補(bǔ)骨脂素外還包括異補(bǔ)骨脂苷,這個(gè)量可達(dá)補(bǔ)骨脂的1%以上,按2010版藥典中補(bǔ)骨脂每人每天10g的使用上限,折合大鼠異補(bǔ)骨脂素用量9mg·kg-1。研究中的結(jié)果,大鼠血液中峰濃度可達(dá)70mg·L-1以上(超過(guò)400μmol·L-1,異補(bǔ)骨脂素分子量186.16),即便是藥后24h血液中異補(bǔ)骨脂素濃度也在2mg·L-1以上(約10μmol·L-1大于其在HepG2細(xì)胞的IC5)。很顯然,按上述推斷異補(bǔ)骨脂素在體內(nèi)也會(huì)導(dǎo)致相似的毒性,這也許可以一定程度地解釋補(bǔ)骨脂所導(dǎo)致的肝損害。

  膽汁酸可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,高濃度的膽汁酸可導(dǎo)致動(dòng)物肝損害。FXR和PXR可以通過(guò)調(diào)節(jié)膽汁酸合成轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)對(duì)抗膽汁酸的毒性,F(xiàn)XR和PXR的缺失會(huì)導(dǎo)致膽汁酸更容易蓄積而產(chǎn)生毒性作用。理論上FXR的激活可以上調(diào)BSEP、OSTα/β、MRPs,下調(diào)NTCP以降低細(xì)胞內(nèi)膽汁酸濃度,F(xiàn)XR還可下調(diào)CYP7A1以減少肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸合成。實(shí)驗(yàn)中異補(bǔ)骨脂素100μmol·L-1,細(xì)胞內(nèi)膽汁酸濃度明顯升高,將會(huì)激活膽汁酸受體FXR、PXR,并使之上調(diào),OSTα上調(diào)和CYP7A1下調(diào)是符合FXR預(yù)期作用的;而作為替代途徑的CYP27A1的上調(diào)可能是因?yàn)楦渭?xì)胞內(nèi)膽汁酸合成限速酶的CYP7A1被抑制的結(jié)果;通過(guò)發(fā)現(xiàn),小鼠在膽酸的誘導(dǎo)下OATP2也是升高的,而且在膽酸的作用下小鼠的OATP2上調(diào)倍數(shù)明顯高于PXR-/-小鼠,盡管未用膽酸處理時(shí)野生型小鼠OATP2絕對(duì)水平低于PXR-/-小鼠肝臟中,但膽酸處理后OATP2水平反而高,提示實(shí)驗(yàn)中OATP2似乎更可能是PXR的調(diào)節(jié)作用。異補(bǔ)骨脂素在25μmol·L-1時(shí),細(xì)胞內(nèi)膽汁酸濃度已經(jīng)有所升高,但與對(duì)照之間的差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而此時(shí)MRP2、MRP3已經(jīng)明顯下調(diào),故異補(bǔ)骨脂素對(duì)MRP2、MRP3的下調(diào)作用顯然早于膽汁酸的淤積,是異補(bǔ)骨脂素對(duì)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)干預(yù)的早期作用點(diǎn),而上調(diào)的OATP2和CYP27A1也許對(duì)抗了上調(diào)的OSTα和下調(diào)的CYP7A1的作用,最終導(dǎo)致膽汁酸在細(xì)胞內(nèi)蓄積,細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的檢測(cè)也證實(shí)細(xì)胞內(nèi)膽汁酸較正常升高了5倍、達(dá)到400μmol·L-1。

  當(dāng)然,體外HepG2細(xì)胞是人源腫瘤細(xì)胞,而中代謝研究是大鼠的數(shù)據(jù),種屬不同可能導(dǎo)致推論有一定差異,最終異補(bǔ)骨脂素在體內(nèi)是否會(huì)同樣影響膽汁酸合成轉(zhuǎn)運(yùn)還有待于研究確證。

【觀(guān)察異補(bǔ)骨脂素體外對(duì)HepG2細(xì)胞毒性和細(xì)胞內(nèi)膽汁酸濃度的影響論】相關(guān)文章:

酸的和甜的教學(xué)設(shè)計(jì)(15篇)04-03

酸的和甜的教學(xué)設(shè)計(jì)15篇08-31

人才測(cè)評(píng)對(duì)人才的影響02-10

酸的和甜的教學(xué)設(shè)計(jì)(匯編15篇)04-07

論提供非審計(jì)服務(wù)對(duì)注冊(cè)會(huì)計(jì)師獨(dú)立性的影響02-01

2017金磚會(huì)議對(duì)廈門(mén)的影響03-14

儒家文化對(duì)企業(yè)的影響05-27

ERP對(duì)企業(yè)管理的影響05-27

養(yǎng)老保險(xiǎn)對(duì)退休待遇的影響08-04

大數(shù)據(jù)技術(shù)對(duì)管理咨詢(xún)公司的影響05-18