談百合固金湯四逆湯含藥血清對(duì)TLR2和TLR4比值的影響論文
本項(xiàng)研究所用四逆湯為《傷寒論》之“經(jīng)方”，百合固金湯典出明代《慎齋遺書》。此兩方之立方均據(jù)張仲景之“六經(jīng)”辯證。且推其早年之“回陽救逆”和“滋陰養(yǎng)肺”功效均與感染性疾病有不解之緣。此兩方之藥理又恰為中醫(yī)“養(yǎng)陰”“回陽”治則之代表。故選此兩方為對(duì)照，觀察機(jī)體感染發(fā)生過程中，兩者對(duì)固有免疫調(diào)節(jié)之異同，極有可能揭示“養(yǎng)陰”“回陽”兩種治則對(duì)免疫細(xì)胞之實(shí)際作用。在基于經(jīng)驗(yàn)的中醫(yī)臨床治則和基于實(shí)證的現(xiàn)代免疫藥理之間牽起一線“姻緣”。
Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面的一類模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor， PRR)，在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)TLR2與TLR4在炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中并非起協(xié)同作用，研究發(fā)現(xiàn)TLR2的表達(dá)能抑制TLR4信號(hào)的過度激活。故推測(cè)TLR2和TLR4可能是“養(yǎng)陰”“回陽”兩種治則對(duì)免疫細(xì)胞，尤其對(duì)固有免疫細(xì)胞的功能產(chǎn)生調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用靶標(biāo)。TLR2和TLR4是識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的主要模式識(shí)別受體，此文選取臨床治療結(jié)核感染的百合固金湯和對(duì)感染性休克起治療作用的四逆湯為例，觀察兩方對(duì)RAW264.7細(xì)胞表面TLR2和TLR4比值是否存在影響，作為深入探討“養(yǎng)陰”“回陽”治則在抗感染作用研究中的引玉之磚。
1 材料與方法
1.1 動(dòng)物、細(xì)胞及細(xì)菌
體重(2.0±0.2)kg，健康雄性新西蘭大白兔10只，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。結(jié)核分枝桿菌株H37Ra，引自上海復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所。
1.2 主要試劑
百合固金湯和四逆湯個(gè)飲片，均購自上海養(yǎng)和堂中藥飲片有限公司;慶大霉素注射液，購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院;DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶，均購自Gibco公司;7H9、7H10培養(yǎng)基，均購自BD Difco公司;TRIzol試劑， 購自Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及2×PCR Mixture， 購自TAKARA 公司;PCR 引物，由上海生工生物工程有限公司合成;FITC標(biāo)記anti-mouse CD282(TLR2)熒光抗體與PE標(biāo)記anti-mouse CD284(TLR4)熒光抗體及其同型對(duì)照，均購自于Biolegend公司;PCR-Fluorescent Probing試劑盒，購自凱杰生物工程(深圳)有限公司。
1.3 細(xì)菌培養(yǎng)
用含10%ADC的7H9培養(yǎng)液，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周觀察1次，一般培養(yǎng)1～2周可見瓶底有細(xì)菌顆粒生長(zhǎng)，(10～15)d達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌用不含血清的DMEM 培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107 個(gè)/ml。
1.4 細(xì)胞培養(yǎng)
小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7按常規(guī)方法用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106 個(gè)/ml，以每孔2ml鋪于6孔板中，24h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.5 含藥血清的制備及細(xì)胞干預(yù)
各方按臨床用藥量乘以動(dòng)物的體表面積系數(shù)求得相應(yīng)給藥量，經(jīng)常規(guī)方法煎煮，濃縮至10倍劑量置4℃冰箱備用。10只新西蘭大白兔隨機(jī)分為空白對(duì)照組(control，4只)、百合固金湯組(BGD，3只)和四逆湯組(SND，3只)。各用藥組按10ml/kg灌服相應(yīng)藥液，對(duì)照組灌服等量生理鹽水。每日1次，連續(xù)4d。于最后一次灌胃1h后心臟采血(最后一次給藥前禁食不禁水12h)分離血清，同組動(dòng)物血清混勻，56℃滅活30min后，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝置-80℃冰箱備用。將RAW264.7細(xì)胞密度調(diào)整為1×106 個(gè)/ml，每組設(shè)3復(fù)孔，2ml/孔鋪于6孔板常規(guī)培養(yǎng)24h后，各用藥組加入含10%相應(yīng)含藥血清的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，對(duì)照組加入含10%空白兔血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，24h后檢測(cè)各組TLR2、TLR4的mRNA 及蛋白表達(dá)量。
1.6 感染模型建立及藥物干預(yù)
模型組用含10%空白兔血清的培養(yǎng)液重懸沉淀細(xì)胞，分別作用24h和48h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。各含藥血清組及對(duì)照組按照細(xì)胞∶細(xì)菌為1∶10的比例加入用10%相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)液重懸的細(xì)菌，密度為1×107 個(gè)/ml的Mtb H37Ra，2ml/孔。
1.7 指標(biāo)測(cè)定
TLR2與TLR4的mRNA表達(dá)以RT-QPCR 的方法檢測(cè)， 以GAPDH 作為內(nèi)參，結(jié)果用2-△△Ct表示。TLR2與TLR4蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，以FACS檢測(cè)細(xì)胞表面TLR2與TLR4的表達(dá)百分比。細(xì)胞吞噬、殺菌能力測(cè)定，以QPCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌DNA含量： 按照凱杰生物工程(深圳)有限公司的PCRFluorescent Probing試劑盒說明做標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算各樣本中的結(jié)核分枝桿菌拷貝數(shù)。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
所有數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間比較采用單因素方差分析，二組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 百合固金湯和四逆湯
含藥血清對(duì)TLR2與TLR4 mRNA表達(dá)的影響及其比值的改變 表1結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，百合組RAW264.7細(xì)胞TLR2mRNA的表達(dá)沒有明顯差異(P>0.05)，但TLR4mRNA 水平較之上升明顯(P<0.05)，TLR2/TLR4 下調(diào)明顯(P <0.05); 四逆組RAW264.7細(xì)胞TLR2及TLR4mRNA的表達(dá)都明顯上升(P<0.05)，但TLR2/TLR4較之無明顯差異。兩用藥組之間比較TLR2、TLR4及TLR2/TLR4的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2.2 百合固金湯和四逆湯
含藥血清對(duì)TLR2與TLR4蛋白表達(dá)的影響及其比值的改變 圖1、表2結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，兩用藥組RAW264.7細(xì)胞表面TLR2和TLR4表達(dá)百分率均有上升，TLR2增加尤為明顯(P<0.05)，兩用藥組之間相比可見百合組TLR2 百分?jǐn)?shù)較四逆組低(P <0.05)，但TLR4百分?jǐn)?shù)較四逆組高(P<0.05)。表中結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，百合組tlr2 p="">0.05)，而四逆組TLR2/TLR4比值明顯高于空白組(P<0.05)，兩用藥組相比，四逆組TLR2/TLR4比值較百合組增長(zhǎng)更明顯(P<0.05)。
2.3 百合固金湯和四逆湯含
藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬殺菌能力的影響 QPCR法檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核桿菌DNA的表達(dá)水平，以細(xì)菌數(shù)量取lg10作統(tǒng)計(jì)處理，圖2顯示Mtb H37Ra與RAW264.7細(xì)胞作用24h和48hQPCR法檢測(cè)到的細(xì)菌含量差異，24h結(jié)果顯示三組之間無明顯差異，而48h的結(jié)果顯示百合組的細(xì)菌含量較其他兩組明顯減少(P<0.05)。各用藥組24h和48h的前后比較發(fā)現(xiàn)百合組較之對(duì)照組和四逆組其殺菌能力明顯提高(P<0.05)，提示百合固金湯抗癆作用可能與調(diào)節(jié)TLR2/TLR4比值相關(guān)。
3 討論
TLR是一種重要的PRR，能夠識(shí)別多種病原相關(guān)分子模式(PAMP)，TLR的研究已涉及到腫瘤，自身免疫性疾病，自身代謝性疾病及各種感染性疾病等多個(gè)領(lǐng)域。在目前發(fā)現(xiàn)的10種人類TLR中，TLR2與TLR4是其中研究得較為清楚的兩種。TLR2可廣泛識(shí)別多種病原相關(guān)分子模式，包括革蘭陽性菌的磷壁酸和肽聚糖、分枝桿菌胞壁組分、細(xì)菌脂蛋白、鉤端螺旋體的.LPS、酵母菌細(xì)胞壁等等，TLR4是第一個(gè)在哺乳動(dòng)物發(fā)現(xiàn)的TLR，可以識(shí)別LPS、磷壁酸、熱休克蛋白、呼吸道合胞病毒F蛋白等配體。以往許多研究顯示TLR2、TLR4能夠啟動(dòng)機(jī)體的固有免疫應(yīng)答，對(duì)病原體發(fā)揮殺滅清除作用。通常認(rèn)為TLR2、TLR4都可經(jīng)MyD88(myeloid differentiation factor 88)途徑調(diào)控炎癥基因的轉(zhuǎn)錄。但也不排除兩者都存在有非MyD88依賴的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。盡管多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為TLR2與TLR4在炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起協(xié)同作用，但Finamore等對(duì)乳酸桿菌的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，TLR2在抑制TLR4信號(hào)過度激活的過程中有重要作用，可能成為抗炎治療的新的靶點(diǎn)。而早在2012年，國內(nèi)就有過類似的報(bào)道，北京解放軍第306醫(yī)院消化內(nèi)科曹艷菊用雙歧三聯(lián)活菌治療急性結(jié)腸炎模型大鼠，隨后檢測(cè)TLR2、TLR4及NF-κB的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益生菌組TLR2表達(dá)較模型組明顯增加，而TLR4表達(dá)明顯下降，NF-κB活性較模型組也明顯降低，提示益生菌可能通過進(jìn)一步增加TLR2 的表達(dá)，并抑制TLR4的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控NF-κB的活性，以緩解腸道炎癥。這些發(fā)現(xiàn)與本實(shí)驗(yàn)所提供的研究結(jié)果似有類似之處，提示某些藥物或微生物確實(shí)可以誘導(dǎo)形成TLR2、TLR4表達(dá)的拮抗局面，并由此而影響感染與炎癥的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。
在本項(xiàng)研究的結(jié)果中，似乎可提示以四逆湯(附子、干姜、甘草)為代表的“回陽救逆”治則與以百合固金湯(百合、玄參、白芍、生地、熟地等)為代表的“養(yǎng)陰”治則在對(duì)感染過程中識(shí)別病原體的PRR表達(dá)類型可產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)格局，如本項(xiàng)研究所顯示�；蛟S百合固金湯對(duì)TLR4表達(dá)增高的調(diào)節(jié)作用與其治療結(jié)核病的臨床功效有著內(nèi)在聯(lián)系(啟動(dòng)炎癥通路，清除細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌);而四逆湯之增高TLR2表達(dá)的作用也是和其治療感染性休克的臨床作用不可分離(有可能通過TLR2/TLR4的拮抗作用，降低了TLR4對(duì)LPS的反應(yīng)敏感性)。盡管這樣的推論與猜測(cè)還需要更多深入的研究去加以驗(yàn)證，但目前的發(fā)現(xiàn)無疑是一個(gè)新的開端。這為中醫(yī)陰陽理論在感染性疾病的實(shí)踐應(yīng)用中所取得的卓越療效提供了可能的科學(xué)解釋。
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