談地黃丸類方對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠HPA 軸的影響論文

　　地黃丸類方是指以地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮等為基礎(chǔ)方衍生的一系列用于治療腎虛的復(fù)方，最早出現(xiàn)在漢代張仲景的《金匱要略》中，又名腎氣丸，用于治療腎氣不足，氣化不及，小便不利的癥狀，現(xiàn)代多用于治療腎陽(yáng)虛證。地黃丸類復(fù)方種類較多，應(yīng)用也較為廣泛，尤其以桂附地黃丸、六味地黃丸、知柏地黃丸等應(yīng)用最多。中醫(yī)治病的原則是辨證施治，現(xiàn)代疾病雖然復(fù)雜，但仍存在明顯的證候差異，兩類不同復(fù)方異病同治的物質(zhì)基礎(chǔ)以及內(nèi)涵有待進(jìn)一步研究。目前，腎虛本質(zhì)的研究主要集中在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、自由基、衰老等方面。本研究采用經(jīng)典腎陽(yáng)虛建模方法氫化可的松注射液肌注2 周造成大鼠腎陽(yáng)虛模型，觀察地黃丸類方對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠的生存狀態(tài)、血漿環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)及血清皮質(zhì)酮(CORT)含量以及cAMP/cGMP 水平的影響，比較3 種地黃丸類方對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠生存狀態(tài)及下丘腦- 垂體- 腎上腺軸(HPA)的影響，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 藥品及試劑

　　六味地黃丸、知柏地黃丸、桂附地黃丸，均為河南省宛西制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為：120309，120301 和120402;氫化可的松注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)：1110211;無(wú)菌生理鹽水，貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20130621;大鼠血漿cAMP 試劑盒， 批號(hào)：DRE68730; 大鼠血漿cGMP 試劑盒， 批號(hào)：DRE68735; 大鼠血漿CRH 試劑盒， 批號(hào)：DRE69547; 大鼠血漿ACTH 試劑盒， 批號(hào)：DRE69548; 大鼠血清CORT 試劑盒， 批號(hào)：DRE68355，均為廣州有田生物科技有限公司產(chǎn)品。

　　1.2 儀器

　　LF26-MESJ 分析天平，香港佳立國(guó)際有限公司;TC-3K 電子天平，深圳市華恒科技有限公司;歐姆龍?bào)w溫計(jì)MC-246，歐姆龍(大連)有限公司;RT-2100C 酶標(biāo)儀，深圳雷杜公司。

　　1.3 動(dòng)物

　　SD 大鼠，SPF 級(jí)，雄性，體質(zhì)量180～220 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(粵)2008-0020。

　　1.4 分組、模型

　　復(fù)制及給藥取SD 大鼠80 只，隨機(jī)分為正常組10 只，氫化可的松組70 只。正常組肌肉注射等體積生理鹽水，其余大鼠每天于后肢外側(cè)肌肉注射氫化可的松注射液25 mg·kg-1，左右后肢交替注射，連續(xù)注射14 d。造模結(jié)束后，將氫化可的松組的70 只大鼠隨機(jī)分成7 組(每組10 只)，即模型組，六味地黃丸高、低劑量組(4，1 g·kg-1)，知柏地黃丸高、低劑量組(4，1 g·kg-1)，桂附地黃丸高、低劑量組(4，1 g·kg-1)。灌胃給藥，各藥物組灌胃相應(yīng)藥物，正常組、模型組給予等體積滅菌蒸餾水，連續(xù)21 d。

　　1.5 一般狀態(tài)

　　觀察實(shí)驗(yàn)期間考察各組大鼠精神狀態(tài)、體質(zhì)量、肛溫的變化。1.6 血漿cAMP、cGMP、CRH、ACTH 及血清CORT 水平的檢測(cè)末次給藥后1 h，腹腔內(nèi)注射10 %水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，分裝于無(wú)肝素鈉離心管和有肝素鈉離心管中，靜止1~2 h，分離血清、血漿，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)大鼠血漿cAMP、cGMP、CRH、ACTH 及血清CORT 含量;計(jì)算cAMP/cGMP。

　　1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　方法采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用LSD 法。

　　2 結(jié)果

　　2.1 對(duì)腎陽(yáng)虛型大鼠生存狀態(tài)的影響與正常組比較，模型組大鼠少動(dòng)怕冷、大便溏瀉、毛發(fā)無(wú)光澤、消瘦萎靡，3 周后狀態(tài)基本無(wú)改變。與模型組比較，桂附地黃丸組給藥2 周后多數(shù)大鼠便溏現(xiàn)象好轉(zhuǎn)，行為活躍，精神狀態(tài)較佳，3 周后基本無(wú)便溏現(xiàn)象，動(dòng)作活躍，毛發(fā)有光澤;六味地黃丸組大鼠在給藥3 周后便溏現(xiàn)象有所好轉(zhuǎn)，但仍有部分大鼠便溏，大鼠狀態(tài)趨向良好，動(dòng)作行為活躍;知柏地黃丸組大鼠給藥3 周后除體重略有升高外，其余狀態(tài)變化較小。給藥前除正常組外，其余大鼠采用隨機(jī)分組，故各組大鼠體質(zhì)量相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05);與模型組比較，給藥2 周，3 種地黃丸方高、低劑量組均能較快的增加大鼠體質(zhì)量(P<0.05，P < 0.01);給藥3 周后，大鼠體質(zhì)量雖有增長(zhǎng)(P < 0.05，P < 0.01)，但增長(zhǎng)速率明顯降低，最終均未達(dá)到正常水平;提示3 種地黃丸方均有糾正大鼠陽(yáng)虛體質(zhì)和改善大鼠體質(zhì)量的作用，且各組無(wú)明顯差異。

　　2.2 對(duì)大鼠肛溫的影響給藥前除正常組外，其余大鼠采用隨機(jī)分組，故各組大鼠肛溫相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05);給藥2 周，與模型組比較，桂附地黃丸高劑量組能升高大鼠肛溫，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);給藥3 周后，桂附地黃丸高、低劑量組仍有升高大鼠肛溫的作用，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);六味地黃丸高、低劑量組和知柏地黃丸高、低劑量組仍有升高大鼠肛溫的作用，但作用不明顯，與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。提示桂附地黃丸效果可能優(yōu)于六味地黃丸和知柏地黃丸。

　　2.3 對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠血漿cAMP、cGMP 水平的影響與正常組比較，各組cAMP 含量均無(wú)明顯變化(P >0.05)，但模型組cGMP 含量升高，且cAMP/cGMP 比值下降(P < 0.01);桂附地黃丸高、低劑量組cGMP含量明顯降低、cAMP/ cGMP 比值明顯升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)，提示桂附地黃丸可能具有溫?zé)�、助�?yáng)的特性，達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽(yáng)平衡的作用，而六味地黃丸和知柏地黃丸在調(diào)節(jié)陰陽(yáng)方面未表現(xiàn)出顯著的作用。

　　3 討論

　　熟地黃主要活性成分為多糖;山藥主要活性成分為山藥多糖;山茱萸多糖是山茱萸生物學(xué)活性物質(zhì)的重要成分。在3 種地黃丸類方中，六味、桂附、知柏地黃丸均以“三補(bǔ)三瀉”為基礎(chǔ)方，其中，熟地黃為君藥，山藥、山茱萸為臣藥，共同組成全方的“三補(bǔ)”部分，3 種地黃丸類方均以補(bǔ)為主，通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫達(dá)到滋補(bǔ)的功效。

　　中醫(yī)陽(yáng)虛指陽(yáng)氣不足或功能衰退的證候，虛寒為陽(yáng)虛證最典型的癥狀。腎精是個(gè)體發(fā)育的基礎(chǔ)，是藏于腎中的精微物質(zhì)。根據(jù)精微物質(zhì)的陰陽(yáng)屬性可分為腎陰、腎陽(yáng)，若陰陽(yáng)平衡遭到破壞，不能自行恢復(fù)時(shí)，即形成腎陰虛或腎陽(yáng)虛的病證。本研究采用氫化可的松肌肉注射14 d 成功復(fù)制腎陽(yáng)虛大鼠模型，造模結(jié)束后，氫化可的松組大鼠體質(zhì)量、肛溫均有顯著降低(P < 0.01)，建模方法可靠。本研究發(fā)現(xiàn)，3種地黃丸類方在體質(zhì)量變化方面均表現(xiàn)出補(bǔ)益的功效，但對(duì)于肛溫的影響，補(bǔ)陽(yáng)類方效果明顯優(yōu)于補(bǔ)陰類方，其作用強(qiáng)度表現(xiàn)為桂附地黃丸>六味地黃丸>知柏地黃丸。

　　國(guó)內(nèi)外對(duì)環(huán)核苷酸與中醫(yī)陰陽(yáng)的關(guān)系做了大量的研究報(bào)道，美國(guó)生物學(xué)家Goldberg 在70 年代初曾提出細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)，認(rèn)為cAMP 與cGMP 通常呈拮抗性共同參與細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)。國(guó)內(nèi)研究顯示，cAMP 和cGMP 在不同疾病虛證患者中的變化規(guī)律，得出相同結(jié)論：凡中醫(yī)辨證陽(yáng)虛者，cAMP/cGMP 比值明顯降低;而各類疾病辨證為陰虛者則表現(xiàn)為cAMP 含量升高，伴以無(wú)明顯降低的cAMP/cGMP 比值。測(cè)定血漿cAMP、cGMP 含量及其比值可以作為幫助判斷陰虛、陽(yáng)虛的一個(gè)客觀指標(biāo)，從而可能對(duì)臨床中病情較為復(fù)雜病例的辨證有一定參考價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，腎陽(yáng)虛模型大鼠血漿中的cAMP/cGMP 比值降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桂附地黃丸可顯著升高cAMP/cGMP 比值，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。桂附地黃丸可能具有溫?zé)�、助�?yáng)的特性，達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽(yáng)平衡的作用。而六味、知柏地黃丸在調(diào)節(jié)陰陽(yáng)方面未表現(xiàn)出顯著的作用。

　　采用氫化可的松可使模型組大鼠垂體前葉的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的釋放受到抑制，形成下丘腦- 垂體- 腎上腺軸(HPA 軸)功能抑制的狀態(tài)，其癥狀表現(xiàn)符合中醫(yī)腎陽(yáng)虛證的臨床表現(xiàn)。本研究采用糖皮質(zhì)激素注射，造成模型組大鼠HPA 軸功能顯著抑制，表明腎陽(yáng)虛證與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)存在密切聯(lián)系。桂附地黃丸和六味地黃丸均可顯著恢復(fù)大鼠HPA 軸功能，其中，桂附地黃丸效果明顯優(yōu)于六味地黃丸，知柏地黃丸無(wú)明顯改善HPA 軸抑制狀態(tài)的作用。

　　本研究對(duì)地黃丸類方的藥理作用進(jìn)行研究，主要考察地黃丸類方對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠治療作用的異同。同時(shí)發(fā)現(xiàn)證型相反的地黃丸類方對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的影響既存在差異，亦存在相似的地方。

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